Москва, Ленинский пр-т, 53
Radiobiotech@lebedev.ru
Radiobiotech@lebedev.ru
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ПРОЕКТА ЗА 2025 ГОД
Работы по проекту «Перспективные комбинированные технологии нейтрон-захватной терапии» выполняются междисциплинарным научным коллективом Физического института им. П.Н. Лебедева РАН и партнера проекта ИЦиГ СО РАН в рамках проекта РНФ № 24-62-00018
Проект нацелен на разработку комбинированных технологий нейтрон-захватной терапии (НЗТ) с применением адресных наночастиц (НЧ), содержащих элементы с высоким сечением поглощения нейтронов, функционализированных биосовместимыми полимерами и специфичными к рецепторам опухолевых клеток лигандами, отдельно и в сочетании с адресными рекомбинантными иммунотоксинами (ИТ). Это позволит значительно повысить эффективность НЗТ за счет увеличения градиента между накоплением агентов в опухолевых и здоровых тканях, улучшения равномерности распределения дозы в опухоли и синергетического действия НЧ в сочетании с адресными ИТ.
На втором этапе реализации проекта в 2025 г. комплекс запланированных исследований выполнен в полном объеме.
Были получены результаты по следующим направлениям:
оптимизация производительности лазерного синтеза коллоидных растворов борсодержащих НЧ, их характеризация, стабилизация биосовместимыми полимерами и векторизация адресными молекулами, наработка рекомбинантных ИТ, исследование их терапевтической эффективности в качестве агентов БНЗТ in vitro и in vivo с проведением расчетных исследований и оптимизацией протоколов облучения.
Проект нацелен на разработку комбинированных технологий нейтрон-захватной терапии (НЗТ) с применением адресных наночастиц (НЧ), содержащих элементы с высоким сечением поглощения нейтронов, функционализированных биосовместимыми полимерами и специфичными к рецепторам опухолевых клеток лигандами, отдельно и в сочетании с адресными рекомбинантными иммунотоксинами (ИТ). Это позволит значительно повысить эффективность НЗТ за счет увеличения градиента между накоплением агентов в опухолевых и здоровых тканях, улучшения равномерности распределения дозы в опухоли и синергетического действия НЧ в сочетании с адресными ИТ.
На втором этапе реализации проекта в 2025 г. комплекс запланированных исследований выполнен в полном объеме.
Были получены результаты по следующим направлениям:
оптимизация производительности лазерного синтеза коллоидных растворов борсодержащих НЧ, их характеризация, стабилизация биосовместимыми полимерами и векторизация адресными молекулами, наработка рекомбинантных ИТ, исследование их терапевтической эффективности в качестве агентов БНЗТ in vitro и in vivo с проведением расчетных исследований и оптимизацией протоколов облучения.
В качестве агентов БНЗТ получены коллоидные растворы сферических НЧ элементного 10B со средним размером 30–50 нм с использованием двух методов: фемтосекундной лазерной абляции (ЛА) твердотельной мишени в жидкости и наносекундной лазерной фрагментации (ЛФ) суспензий микропорошка. Оптимизация технологии изготовления твердотельных мишеней из порошка обогащенного 10B и схемы установки для ЛА позволила двукратно повысить производительность синтеза НЧ. Модификация поверхности НЧ полимером Silane-PEG-COOH обеспечила стабильность коллоидных растворов НЧ в культуральной среде. Каркасные адресные белки Affibody ZHER2:342, DARPin_9-29 и адресный ИТ DARP-LoPE, специфичные к рецептору HER2 (рак груди и др.) выделены и очищены методами автоиндукции в клетках E. coli (штамм BL21(DE3)) и металл-аффинной хроматографии. Впервые получены стабильные конъюгаты адресных наноформуляций (НФ) 10B-PEG-AFF на основе ЛА-НЧ (средний гидродинамический размер – 125±39 нм) и ЛФ-НЧ (149±52 нм) карбодиимидным методом. Получены адресные нанолипосомы DARPin-4-L-10BPA-D-Fructose со средним гидродинамическим размером 152±53 нм, загруженные комплексом борфенилаланина с фруктозой, внешняя поверхность которых была впервые модифицирована адресным белком DARPin_9-29.
Подтверждена высокая специфичность связывания наноагентов с клетками-мишенями, экспрессирующими опухоль-ассоциированный антиген HER2, и изучена динамика интернализации агентов в клетки после связывания с рецептором HER2. Показано отсутствие цитотоксического действия 10B-PEG-AFF на клеточные культуры линий BT-474, SKOV-3, SK-BR-3, EMT-HER2 и BJ-5TA в концентрациях 10-40 мкг/мл. Максимальная внутриклеточная концентрация 10B составляет от 70 до 100 мкг/106 клеток (ICP-MS). Показана специфичность накопления 10B-PEG-AFF в HER2-положительных клетках по сравнению с контрольными образцами. Впервые установлено, что совместное воздействие на клетки препаратов DARP-loPE и 10B-PEG-AFF не приводит к синергетическому усилению токсичности, оптимальная концентрация DARP-loPE – 1 нМ.
Изучено ex vivo биораспределение 10B в опухоли и органах иммунодефицитных мышей линии SCID с подкожными ксенографтами BT-474 и U-87 MG после однократного внутривенного (в/в) или внутриопухолевого (в/о) введения адресных НФ 10B-PEG-AFF на основе ЛА-НЧ и неадресных ЛФ-НЧ 10B-PEG. Установлено, что в/о введение 10B-PEG-AFF обеспечивает высокое содержание 10B в опухоли от 24 мкг/г до 138 мкг/г (ICP-AES), при этом соотношения концентраций 10B опухоль/кровь и опухоль/окружающая ткань были высокими при минимальном накоплении в печени и отсутствии 10B в почках.
Исследованы токсические эффекты однократного в/в введения ИТ DARP-loPE в дозах 17, 55 и 150 мг/кг, а также пятикратных в/в введений в дозах 1, 3, 9 и 30 мг/кг отдельно и в сочетании с в/в инъекцией 10B-PEG-AFF в дозах 30 и 60 мг/кг. Установлено отсутствие значимых отклонений в состоянии организма животных, получавших DARP-loPE в дозе 17 или 55 мг/кг. При пятикратных в/в введениях максимальная доза, не вызывающая каких-либо отклонений в состоянии организма мышей, составила 9 мг/кг.
Для исследований терапевтической эффективности БНЗТ на установке VITA проведено облучение клеточных культур для in vitro исследований с применением 10B-PEG-AFF. Для in vivo исследований проведено облучение иммунодефицитных мышей линии SCID с подкожными ксенографтами карциномы молочной железы человека BT-474.
Пространственное распределение компонент поглощённой дозы при облучении определено с помощью разработанных программных фантомов биологических объектов с моделями опухоли в среде Geant4. Показано, что применение замедлителя Poly‑Biz позволяет в 2,5 раза снизить интенсивность потока паразитного гамма‑излучения. Впервые в программной среде Geant4 для in vitro стенда установки VITA рассчитаны оптимальные толщины замедлителей с учётом пространственного расположения и количества облучаемых криоампул с клеточной суспензией.
Проведена модернизация спектрометрического комплекса установки VITA, включающая установку и тестирование спектрометра на основе полупроводникового HPGe детектора, а также монтаж цельнолитой толстостенной свинцовой трубы для защиты детектора и коллимации пучка гамма-излучения со встроенной системой внутренней калибровки на основе радиоактивного источника 108mAg. С применением этого комплекса впервые проведено измерение интенсивности ядерных реакций в процессе облучения лабораторных животных с ксенографтными опухолями.
Впервые установлено (с помощью МТТ-теста и клоногенного анализа) достоверное снижение выживаемости и полное ингибирование колониеобразующей способности клеток всех исследуемых линий после БНЗТ с использованием 10B-PEG-AFF по сравнению с контрольными группами.
Показано, что проведение БНЗТ с в/о введением 10B-PEG-AFF в дозе 60 мг/кг приводит к замедлению скорости роста ксенографтов опухоли молочной железы человека BT-474 у самок иммунодефицитных мышей линии SCID по сравнению со значениями в контрольной группе. При этом отсутствует статистически значимая разница в динамике массы тела животных между экспериментальными и контрольными группами на протяжении всего периода наблюдения.
Разработанные новые адресные борсодержащие нанопрепараты, адресные рекомбинантные ИТ и не имеющие аналогов в мире комбинированные технологии БНЗТ на их основе могут быть рекомендованы медицинскому сообществу для апробации на клинических установках: в НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина МЗ РФ (2026 г.) и действующих медицинских установках в других странах.
Подтверждена высокая специфичность связывания наноагентов с клетками-мишенями, экспрессирующими опухоль-ассоциированный антиген HER2, и изучена динамика интернализации агентов в клетки после связывания с рецептором HER2. Показано отсутствие цитотоксического действия 10B-PEG-AFF на клеточные культуры линий BT-474, SKOV-3, SK-BR-3, EMT-HER2 и BJ-5TA в концентрациях 10-40 мкг/мл. Максимальная внутриклеточная концентрация 10B составляет от 70 до 100 мкг/106 клеток (ICP-MS). Показана специфичность накопления 10B-PEG-AFF в HER2-положительных клетках по сравнению с контрольными образцами. Впервые установлено, что совместное воздействие на клетки препаратов DARP-loPE и 10B-PEG-AFF не приводит к синергетическому усилению токсичности, оптимальная концентрация DARP-loPE – 1 нМ.
Изучено ex vivo биораспределение 10B в опухоли и органах иммунодефицитных мышей линии SCID с подкожными ксенографтами BT-474 и U-87 MG после однократного внутривенного (в/в) или внутриопухолевого (в/о) введения адресных НФ 10B-PEG-AFF на основе ЛА-НЧ и неадресных ЛФ-НЧ 10B-PEG. Установлено, что в/о введение 10B-PEG-AFF обеспечивает высокое содержание 10B в опухоли от 24 мкг/г до 138 мкг/г (ICP-AES), при этом соотношения концентраций 10B опухоль/кровь и опухоль/окружающая ткань были высокими при минимальном накоплении в печени и отсутствии 10B в почках.
Исследованы токсические эффекты однократного в/в введения ИТ DARP-loPE в дозах 17, 55 и 150 мг/кг, а также пятикратных в/в введений в дозах 1, 3, 9 и 30 мг/кг отдельно и в сочетании с в/в инъекцией 10B-PEG-AFF в дозах 30 и 60 мг/кг. Установлено отсутствие значимых отклонений в состоянии организма животных, получавших DARP-loPE в дозе 17 или 55 мг/кг. При пятикратных в/в введениях максимальная доза, не вызывающая каких-либо отклонений в состоянии организма мышей, составила 9 мг/кг.
Для исследований терапевтической эффективности БНЗТ на установке VITA проведено облучение клеточных культур для in vitro исследований с применением 10B-PEG-AFF. Для in vivo исследований проведено облучение иммунодефицитных мышей линии SCID с подкожными ксенографтами карциномы молочной железы человека BT-474.
Пространственное распределение компонент поглощённой дозы при облучении определено с помощью разработанных программных фантомов биологических объектов с моделями опухоли в среде Geant4. Показано, что применение замедлителя Poly‑Biz позволяет в 2,5 раза снизить интенсивность потока паразитного гамма‑излучения. Впервые в программной среде Geant4 для in vitro стенда установки VITA рассчитаны оптимальные толщины замедлителей с учётом пространственного расположения и количества облучаемых криоампул с клеточной суспензией.
Проведена модернизация спектрометрического комплекса установки VITA, включающая установку и тестирование спектрометра на основе полупроводникового HPGe детектора, а также монтаж цельнолитой толстостенной свинцовой трубы для защиты детектора и коллимации пучка гамма-излучения со встроенной системой внутренней калибровки на основе радиоактивного источника 108mAg. С применением этого комплекса впервые проведено измерение интенсивности ядерных реакций в процессе облучения лабораторных животных с ксенографтными опухолями.
Впервые установлено (с помощью МТТ-теста и клоногенного анализа) достоверное снижение выживаемости и полное ингибирование колониеобразующей способности клеток всех исследуемых линий после БНЗТ с использованием 10B-PEG-AFF по сравнению с контрольными группами.
Показано, что проведение БНЗТ с в/о введением 10B-PEG-AFF в дозе 60 мг/кг приводит к замедлению скорости роста ксенографтов опухоли молочной железы человека BT-474 у самок иммунодефицитных мышей линии SCID по сравнению со значениями в контрольной группе. При этом отсутствует статистически значимая разница в динамике массы тела животных между экспериментальными и контрольными группами на протяжении всего периода наблюдения.
Разработанные новые адресные борсодержащие нанопрепараты, адресные рекомбинантные ИТ и не имеющие аналогов в мире комбинированные технологии БНЗТ на их основе могут быть рекомендованы медицинскому сообществу для апробации на клинических установках: в НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина МЗ РФ (2026 г.) и действующих медицинских установках в других странах.