Москва, Ленинский пр-т, 53
Radiobiotech@lebedev.ru
Radiobiotech@lebedev.ru
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ПРОЕКТА ЗА 2024 ГОД
Работы по проекту «Перспективные комбинированные технологии нейтрон-захватной терапии» выполняются междисциплинарным научным коллективом Физического института им. П.Н. Лебедева РАН и партнера проекта ИЦиГ СО РАН в рамках проекта РНФ № 24-62-00018
Проект нацелен на разработку комбинированных технологий нейтрон-захватной терапии (НЗТ) с применением адресных наночастиц (НЧ), содержащих элементы с высоким сечением поглощения нейтронов, функционализированных биосовместимыми полимерами и специфичными к рецепторам опухолевых клеток лигандами, отдельно и в сочетании с адресными рекомбинантными иммунотоксинами (ИТ). Это позволит значительно повысить эффективность НЗТ за счет увеличения градиента между накоплением агентов в опухолевых и здоровых тканях, улучшения равномерности распределения дозы в опухоли и синергетического действия НЧ в сочетании с адресными ИТ.
В 2024 г. в соответствии с планом-графиком (ПГ) выполнены работы первого этапа проекта.
На первом этапе реализации проекта в 2024 г. в Физическом институте им. П.Н. Лебедева РАН (ФИАН, г. Москва) был сформирован научный междисциплинарный коллектив, объединяющий ученых, являющихся лидерами в различных областях знаний (ядерная и лазерная физика, био- и молекулярная химия, биология и др.). В качестве привлеченного к выполнению проекта партнера выступил Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики СО РАН (ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск), располагающий инфраструктурой мирового уровня, и сотрудниками, обладающими уникальными компетенциями в работе с иммунодефицитными животными.
В 2024 году был проведен комплекс запланированных исследований в полном объеме. Были получены результаты по следующим направлениям:
Проект нацелен на разработку комбинированных технологий нейтрон-захватной терапии (НЗТ) с применением адресных наночастиц (НЧ), содержащих элементы с высоким сечением поглощения нейтронов, функционализированных биосовместимыми полимерами и специфичными к рецепторам опухолевых клеток лигандами, отдельно и в сочетании с адресными рекомбинантными иммунотоксинами (ИТ). Это позволит значительно повысить эффективность НЗТ за счет увеличения градиента между накоплением агентов в опухолевых и здоровых тканях, улучшения равномерности распределения дозы в опухоли и синергетического действия НЧ в сочетании с адресными ИТ.
В 2024 г. в соответствии с планом-графиком (ПГ) выполнены работы первого этапа проекта.
На первом этапе реализации проекта в 2024 г. в Физическом институте им. П.Н. Лебедева РАН (ФИАН, г. Москва) был сформирован научный междисциплинарный коллектив, объединяющий ученых, являющихся лидерами в различных областях знаний (ядерная и лазерная физика, био- и молекулярная химия, биология и др.). В качестве привлеченного к выполнению проекта партнера выступил Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики СО РАН (ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск), располагающий инфраструктурой мирового уровня, и сотрудниками, обладающими уникальными компетенциями в работе с иммунодефицитными животными.
В 2024 году был проведен комплекс запланированных исследований в полном объеме. Были получены результаты по следующим направлениям:
- численное моделирование ядерно-физических процессов;
- оптимизация технологий лазерного синтеза, стабилизации и функционализации коллоидных растворов НЧ элементного бор-10 (10B);
- определение перспективных адресных белков и адресных рекомбинантных ИТ, разработка технологий их выделения и очистки;
- оптимизация режимов облучения и проведение in vitro и in vivo экспериментов по исследованию терапевтической эффективности применения адресных НЧ.
Проведено численное моделирование ядерно-физических процессов в НЗТ методом Монте-Карло в среде Geant4. Создана модель нейтроногенерирующей системы ускорительного источника нейтронов VITA, используемого для исследований в области бор-нейтронозахватной терапии (БНЗТ). Получены пространственные и энергетические распределения интенсивности потока нейтронов в конфигурации для облучения биологических объектов при энергии протонов 2,05 МэВ. Показано, что расчётные значения интенсивности потока нейтронов различных энергетических диапазонов находятся в согласии с экспериментальными данными. Созданная модель будет использована при реализации следующих этапов проекта для дозового планирования экспериментов по облучению биологических объектов in vitro и in vivo и дальнейшей оптимизации системы формирования нейтронного поля с целью увеличения терапевтического индекса в НЗТ.
Для синтеза эффективных борсодержащих агентов на основе адресных НЧ были разработаны методы лазерного синтеза НЧ элементного 10B, обогащённых изотопом 10B (степень обогащения 85%). Использование технологии нс лазерной фрагментации суспензий микропорошка позволило синтезировать НЧ с аморфной структурой и средним размером около 80 нм. Физико-химические свойства синтезированных коллоидных растворов НЧ были охарактеризованы с применением методов электронной микроскопии, элементного и структурного анализа. Проведена стабилизация коллоидных растворов путем модификации поверхности НЧ полиэтиленгликолем (Silane-PEG). Поликристаллические НЧ после покрытия имели средний гидродинамический размер порядка 100 нм, аморфные НЧ — около 140 нм. Оба типа покрытых НЧ были стабильны в воде в течение 1 месяца и в клеточной среде с добавлением 10% сыворотки как минимум в течение одних суток. НЧ элементного 10B конъюгировали с векторными белками аффибоди для адресной доставки к HER2-положительным раковым клеткам. Для ковалентной конъюгации НЧ элементного 10B были покрыты полимером со свободными карбоксильными группами Silane-PEG-COOH. Конъюгат 10B-PEG-COOH-AFF-AF488 связывался с HER2-положительными клетками (по отношению delta-MFI для клеток SKOVip и CHO) в 2,6±0,2 раз сильнее.
В in vitro исследованиях определено накопление НЧ элементного 10B клетками методом ICP-AES. Установлена зависимость концентрации 10B в клетках от типа НЧ и клеточных линий. Показано, что НЧ 10B, покрытые Silane-PEG, являются не токсичными как для опухолевых клеточных культур, так и для фибробластов в концентрациях 10B до 80 мкг/мл. Проведено облучение клеточных культур потоком нейтронов на ускорительном источнике нейтронов VITA. Обнаружено снижение клоногенной активности всех клеточных культур при инкубации клеток с НЧ элементного 10B в концентрации 40 мкг/мл и последующем облучении нейтронами. Наибольший терапевтический эффект был обнаружен для клеточной линии BT-474, доля выживших клеток составила менее 1%.
Партнером проекта ИЦиГ СО РАН в рамках решения задачи по оптимизации моделей солидных опухолей для тестирования эффективности НЗТ in vivo и разработки технологий режимов введения коллоидных растворов элементного 10B мышам с перевиваемыми опухолями был получен образ ксенографтов карциномы молочной железы BT-474, меланомы SK-Mel-28 и глиомы человека U87 на иммунодефицитных мышах. Исследована динамика роста ксенографтов в течение 31 суток, анализ объемов ксенографтов показал, что наиболее подходящими для терапии опухолевые узлы становятся уже на 7-10 сутки от инокуляции клеток. Показана возможность использования всех исследуемых моделей для дальнейшего изучения новых борсодержащих препаратов для НЗТ. Исследование токсичности НЧ элементного 10B не выявило значимых эффектов при внутривенном, внутрибрюшинном и подкожном введениях. Установлено, что исследуемые НЧ в выбранных объемах введений (150 мкл/мышь) могут быть использованы в дальнейших исследованиях НЗТ в дозах менее 100 мг/кг.
Начаты не имеющие аналогов в мире работы по комбинированным технологиям НЗТ с использованием адресных рекомбинантных ИТ. Были оптимизированы условия экспрессии, выделения и очистки адресного белка DARPin_9-29, высокоспецифично связывающегося с доменом I рецептора эпидермального фактора роста человека 2 типа (HER2), и адресного рекомбинантного ИТ DARP-LoPE. Проведена конъюгация указанных белков с флуоресцентным красителем, продемонстрировано специфическое взаимодействие с HER2-положительными клетками BT-474, SKOV-3 и EMT-HER2 методами проточной цитометрии и конфокальной микроскопии. Методом МТТ-теста проведена оценка цитотоксического действия адресного токсина DARP-LoPE на HER2-положительные клетки.
Для синтеза эффективных борсодержащих агентов на основе адресных НЧ были разработаны методы лазерного синтеза НЧ элементного 10B, обогащённых изотопом 10B (степень обогащения 85%). Использование технологии нс лазерной фрагментации суспензий микропорошка позволило синтезировать НЧ с аморфной структурой и средним размером около 80 нм. Физико-химические свойства синтезированных коллоидных растворов НЧ были охарактеризованы с применением методов электронной микроскопии, элементного и структурного анализа. Проведена стабилизация коллоидных растворов путем модификации поверхности НЧ полиэтиленгликолем (Silane-PEG). Поликристаллические НЧ после покрытия имели средний гидродинамический размер порядка 100 нм, аморфные НЧ — около 140 нм. Оба типа покрытых НЧ были стабильны в воде в течение 1 месяца и в клеточной среде с добавлением 10% сыворотки как минимум в течение одних суток. НЧ элементного 10B конъюгировали с векторными белками аффибоди для адресной доставки к HER2-положительным раковым клеткам. Для ковалентной конъюгации НЧ элементного 10B были покрыты полимером со свободными карбоксильными группами Silane-PEG-COOH. Конъюгат 10B-PEG-COOH-AFF-AF488 связывался с HER2-положительными клетками (по отношению delta-MFI для клеток SKOVip и CHO) в 2,6±0,2 раз сильнее.
В in vitro исследованиях определено накопление НЧ элементного 10B клетками методом ICP-AES. Установлена зависимость концентрации 10B в клетках от типа НЧ и клеточных линий. Показано, что НЧ 10B, покрытые Silane-PEG, являются не токсичными как для опухолевых клеточных культур, так и для фибробластов в концентрациях 10B до 80 мкг/мл. Проведено облучение клеточных культур потоком нейтронов на ускорительном источнике нейтронов VITA. Обнаружено снижение клоногенной активности всех клеточных культур при инкубации клеток с НЧ элементного 10B в концентрации 40 мкг/мл и последующем облучении нейтронами. Наибольший терапевтический эффект был обнаружен для клеточной линии BT-474, доля выживших клеток составила менее 1%.
Партнером проекта ИЦиГ СО РАН в рамках решения задачи по оптимизации моделей солидных опухолей для тестирования эффективности НЗТ in vivo и разработки технологий режимов введения коллоидных растворов элементного 10B мышам с перевиваемыми опухолями был получен образ ксенографтов карциномы молочной железы BT-474, меланомы SK-Mel-28 и глиомы человека U87 на иммунодефицитных мышах. Исследована динамика роста ксенографтов в течение 31 суток, анализ объемов ксенографтов показал, что наиболее подходящими для терапии опухолевые узлы становятся уже на 7-10 сутки от инокуляции клеток. Показана возможность использования всех исследуемых моделей для дальнейшего изучения новых борсодержащих препаратов для НЗТ. Исследование токсичности НЧ элементного 10B не выявило значимых эффектов при внутривенном, внутрибрюшинном и подкожном введениях. Установлено, что исследуемые НЧ в выбранных объемах введений (150 мкл/мышь) могут быть использованы в дальнейших исследованиях НЗТ в дозах менее 100 мг/кг.
Начаты не имеющие аналогов в мире работы по комбинированным технологиям НЗТ с использованием адресных рекомбинантных ИТ. Были оптимизированы условия экспрессии, выделения и очистки адресного белка DARPin_9-29, высокоспецифично связывающегося с доменом I рецептора эпидермального фактора роста человека 2 типа (HER2), и адресного рекомбинантного ИТ DARP-LoPE. Проведена конъюгация указанных белков с флуоресцентным красителем, продемонстрировано специфическое взаимодействие с HER2-положительными клетками BT-474, SKOV-3 и EMT-HER2 методами проточной цитометрии и конфокальной микроскопии. Методом МТТ-теста проведена оценка цитотоксического действия адресного токсина DARP-LoPE на HER2-положительные клетки.