На четвертом этапе реализации проекта с целью развития бинарных технологий протонной терапии с использованием наночастиц (НЧ) была проведена отработка и оптимизация лазерного синтеза наночастиц, в том числе композитных, на основе новых материалов, перспективных для сенсибилизации протонной терапии (например, TiN, ZrN, HfN, Au-Fe) и методов создания наноформуляций на основе новых лазерно-синтезированных материалов путём их покрытия оболочкой из биосовместимых полимеров. Наработаны наноформуляции (НФ) для экспериментов по определению терапевтического эффекта бинарного воздействия in vitro и in vivo на моделях мышей. Проведена функционализация наиболее перспективных наноформуляций адресными молекулами для проведения in vivo экспериментов на иммунодефицитных мышах с ксенографтом опухоли человека.
Отработка технологий лазерного синтеза наночастиц проводилась совместно с профессором Индраджитом Роем (университет Дели, Индия). Были синтезированы сверхчистые коллоидные растворы НЧ на основе TiN, ZrN, HfN, Au, Au-Fe, Bi в количестве, необходимом для проведения работ по четвертому этапу проекта, и проведена их комплексная физико-химическая характеризация с использованием современных комплементарных аналитических методов.
Проведены биологические исследования выживаемости и клоногенной активности опухолевых клеток (клеточные культуры линий EMT6/P и BT-474) после облучения сканирующим протонным пучком в присутствии наработанных наноформуляций (Bi-Pluroniс, Au-PEG, ZrN-Chit-Affibody). Установлено, что наночастицы Bi-Pluroniс обеспечивают выраженный радиосенсибилизирующий эффект в отношении клеточных культур линии EMT6/P при концентрациях 25 и 50 мкг/мл и дозе облучения 3 Гр протонным пучком в пике Брэгга, что доказывает перспективность их использования в качестве радиосенсибилизирующего агента для протонной терапии; НФ на основе НЧ золота (Au-PEG) демонстрируют высокий уровень биосовместимости и выраженный радиосенсибилизирующий эффект в отношении клеточных культур линии BT-474 в концентрации 50 и 100 мкг/мл; НФ ZrN-Chit-Affibody обладают повышенной тропностью культуре клеток линии BT-474 и эффективно накапливаются в них, обеспечивая радиационно-индуцированное цитотоксическое действие.
Проведены эксперименты по исследованию переносимости и противоопухолевой эффективности НФ ZrN-Chit-Affibody и Au-Fe-PEG-Affibody при проведении бинарной протонной терапии на мышах BALB/c с моделью перевиваемых опухолей EMT-HER2, и НФ HfN-PEG-DARPin при проведении бинарной протонной терапии на самках бестимусных мышей Nu/j с ксенографтом карциномы протоков молочной железы человека BT-474.
Установлено, что внутривенное (Au-Fe-PEG-Affibody, 3 мг/мышь) и комбинированное (внутривенное и внутриопухолевое) введение (ZrN-Chit-Affibody 0,5 мг в/в + ZrN-Chit 2,5 мг в/о) НФ переносятся мышами удовлетворительно. Показано, что бинарная протонная терапия с использование НФ Au-Fe-PEG-Affibody и ZrN-Chit-Affibody в используемых дозах и схемах применения усиливает протон-индуцированное (15 Гр) торможение роста опухолевых узлов EMT-HER2 на 15-20%.
Установлено, что комбинированное (внутривенное и внутриопухолевое) введение НФ HfN-PEG-DARPin (0,5 мг в/в + 2,5 мг в/о) переносятся мышами удовлетворительно. Показано, что бинарная протонная терапия с применением НФ HfN-PEG-DARPin в используемых дозах и схемах применения усиливает протон-индуцированное (15 Гр) торможение роста карциномы BT-474 на 15-30%.